Nosotros usaremos un gel de agarosa y no un gel de poliacrilamida ya que las moléculas de DNA de solo algunos miles de pares de bases, no pueden penetrar la poliacrilamida. La agarosa es un polisacárido que forma un gel que forma una trama de fibras poliméricas que retarda el paso de las moléculas de ácidos nucleicos, en mayor medida cuanto más grandes sean estas.
Dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga eléctrica el parámetro que rige el avance (a = F/m), es realmente la relación carga masa. Para un ácido nucleico (DNA o RNA) la carga eléctrica es proporcional a la longitud de nucleótidos (posee una carga negativa –el fosfato- por cada nucleótido), por lo que la relación carga masa (q/m) es la misma para todas las moléculas. Por eso podemos estar seguros de que el efecto de retardo de las moléculas en el gel se debe al tamaño (Mr) y no a la carga.
Como el gel es poroso, la forma de la molécula interviene en la corrida. Una molécula de DNA lineal de igual número de nucleótidos que otra no lineal (más compacta, súper enrollada -supercoil-, correrán a distintas velocidad. Por lo que para estimar el peso molecular de una molécula de ácido nucleico, suele digerírsela con una enzima de restricción de modo de linealizarla. Existen tres isoformas para los plásmidos no digeridos, que nosotros vamos a correr: linealizada (L); súper enrollada (SC -supercoil-) que corre siempre más lejos que la linealizada, y circular no súper enrollada (CA –circulo abierto) forma producida cuando se rompe la unión fosfodiéster en solo una de las dos hebras del DNA, de manera de relajar la torsión de las hebras.
La distancia que van a migrar en el gel es
Distancia (cm) aprox. = 1/Log PM = Peso molecular
Como resultado neto, la electroforesis en gel de agarosa de según su tamaño, expresado en nucleótidos (si son de hebra sencilla) o en pare de bases (si son de doble hebra).
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