COLORACIÓN Y OTROS MÉTODOS DE DETECCIÓN

• Coloración de Loefler

SOLUCIÓN A
– Azul de metileno 0.3g
–Alcohol etílico (95%) 30c.c

SOLUCIÓN B
–KOH (0.1%) 100 c.c. Mezcle las soluciones A y B. La mezcla debe hacerse cuidadosamente

• Coloración de Gram

Se aplica al frontis durante 30 seg. la solución de Cristal-Violeta, y luego se lava la preparación con solución yodo yodurada de Lugol, que se deja actuar sobre ella 30 seg. Se vierte y se aplica sobre el preparado alcohol etílico al 95% hasta que las capas más gruesas del frotis dejen de perder colorante (quedan coloreadas las gram-positivas), por último se aplica la coloración de contraste.· Solución de Cristal-VioletaSOLUCIÓN A– Cristal Violeta (85% de cont. de colorante) 2g– Alcohol etílico (95º) 20c.c.
SOLUCIÓN B– Oxalato amónico 0.8g– Agua destilada 20c.c.Dilúyase la solución al 10% en agua destilada y mezcle con igual volumen de solución B

• Coloración de Ziehl - Neelsen

Utilizada para ver bacilos tuberculosos o células con abundante material céreo (ácido-resistencia).El frotis se extiende seco y fijo por el calor. Se vierte sobre el la solución colorante (fucsina fenicada) en cantidad abundante. Esta es calentada hasta 90º C sobre baño maría, durante 5 minutos de ese modo se ablanda la cubierta cérea y se deja impregnar por el colorante. Después de lavar la preparación durante 5 minutos con alcohol frío de 95º que contenga 5 a 10% de HCl, los microorganismos que retienen el rojo son acidorresistentes. Se tiñe a continuación la preparación con azul de metileno o verde brillante como coloración de contraste.

• Solución de fucsina fenicada

SOLUCIÓN A
–Fucsina básica 0.3g
–Alcohol etílico al (95º) 10c.c.

SOLUCIÓN B
–Ácido fénico (cristales fundidos) 5c.c.
–Agua destilada 95c.c. Mezcle las soluciones A y B. Conserve con cuidado.

• Coloración Negativa

La coloración negativa o método de Dorner colorea el campo y no a las bacterias (portaobjetos libres de grasa).– Nigrosín 10g– Agua 100c.c.Hiérvase durante 30 minutos y agréguese 0.5c.c. de formalina. Fíltrese a través de papel filtro a razón de 2c.c. por tubo. Deposítese en el porta un asa de suspensión a examinar, inmediatamente adiciónese una cantidad igual de solución de nigrosín. Mezcle y extienda una película fina. No moje el porta ni lo caliente.

• Método de Albert

Para observar gránulos de volutina.

SOLUCIÓN A
–Azul de Toluidina 0.15g
–Verde de Metilo 0.2g
–Ácido acético (glacial) 1c.c.
–Alcohol (95º) 2c.c.
–Agua 100c.c. Déjese en reposo 24 hs., fíltrese con papel filtro.

SOLUCIÓN B
–Yodo como en coloración de Gram
1) Prepárese el frotis en la forma corriente
2) Sumérjase en la solución A 1 minuto. Lávese con aguay séquese con papel adecuado
3) Tíñase con la solución B durante 1 minuto, lávese y séquese se con papel.Los gránulos aparecen negros, las demás partes obscuras o verde claro.

• Método de Leifson

Usada para teñir flagelos

SOLUCIÓN A
–NaCl 1.5% en H2O destilada

SOLUCIÓN B
–Ácido tánico 3% en H2O destilada

SOLUCIÓN C
–Acetato de pararosanilina 0.9
–Clorhidrato e pararosanilina 0.3g (o 1.2g de fucsina básica garantizada)
–Alcohol etílico 100c.c. Mézclese A, B y C en iguales proporciones y mantenga la mezcla en un frasco hermético aproximadamente a 4º C.Sobre la extensión deposite 1c.c. de colorante, lleve a temperatura de laboratorio 7 a 15 minutos. Lavar abundante y delicadamente; no escurrir primero el colorante. Coloración de contraste con azul de metileno.

• Coloración de CápsulasMétodo de Weich (modificado)

SOLUCIÓN A
“Cristal Violeta”
–Solución alcohólica saturada de cristal violeta
–Agua destilada

SOLUCIÓN B
–Solución de sulfato de cobre al 10%. Haga un frotis fino, séquese al aire, fíjese por calor suave, cúbrase con la solución A, caliéntese hasta producir vapores por un segundo (no debe hervir). No se usa agua, lávese abundante e inmediatamente con la solución de sulfato de cobre, séquese mediante papel inmediatamente. Los microorganismos se ven en púrpura y las cápsulas como halos en azul desvariado.

• Reacción de Feulgen

Para coloración de ADN.
No tiñe ARN.
Color: magenta o rojo.
1) Fijar en alcohol etílico (95%) durante 48 hs.
2) Aplicar cloroformo durante 30” a la extensión húmeda, secar al aire.
3) Sumergir durante 10 a 15 minutos en HCl N/I, a 60º C. Pasar por HCl N/I frío.
4) Teñir con reactivo de Schiff, en el vacío, en recipiente cerrado: de 2 a 6 horas.

• Reactivo de Schiff

Es leucosina o bisulfato de fucsina. Sirve para coloración de ADN, almidón, celulosa, pectinas, muceínas, mucoproteínas y quininas. Es incoloro pero forma un color rojo estable al unirse a grupos aldehídos.

–Fucsina básica 1g
–Agua 200c.c.Calentar, agitar, filtrar. Al filtrado agregar HCl N/I 20c.c.; Bisulfito de Na anhídrido, 2g. Tapar herméticamente y dejar en reposo durante 24hs. En lugar oscuro. Lavar suavemente con solución de bisulfito al 1% y luego con agua. Secado y coloración de fondo con una tinción verde. Examinar con objetivo de inmersión al aceite (o montar con cubre; con solución de bisulfito sódico al 1%, examinar en húmedo)El Método del Ácido Peryódico-Schiff, más conocido como PAS se emplea para determinar la presencia de moléculas como el glucógeno, glucoproteínas y glucosaminoglucanos.

• Tinción de esporas

También llamada tinción de Wirtz (flamear hasta calentar).
1) Aplicar verde de malaquita saturado (aprox. 7.6%) durante 10 minutos.
2) Lavar con agua corriente durante 10 segundos.
3) Aplicar solución acuosa de safranina a 0.25% durante 15”.
4) Lavar con agua corriente, secar con papel absorbente y luego al calor.

• Reactivo de Earlich

Este reactivo indica la presencia de Indol
–Alcohol etílico (95%) 380c.c.
–HCl (concentrado) 80c.c.
–Paradimetil-amidobenzaldehído 4g. Si se encuentra Indol toma un tinte rozado

• Reactivo de Kovacks

Determina la producción de Indol. Un halo fucsia rojo es positivo, mientras que si no aparece dicho halo es negativo.

• Reacción para la determinación de la catalasa

–Peróxido de hidrógeno. La aparición de burbujas sobre el frotis indica una respuesta positiva.