REALIZACIÓN DE EXTENDIDOS Y PREPARADOS DE TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES PARA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

La mayoría de las personas suelen tomar objetos y colocarlos directamente en el portaobjeto, con la esperanza de ver algo emocionante y, como poco o nada pueden ver, se desilusionan y allí termina su interés por el microscopio. Lo que deseamos ver en un microscopio debe ser preparado de antemano para que su observación sea posible. Para acondicionar los objetos existen técnicas que se valen de distintos procedimientos. Estas técnicas, algunas sencillas, otras relativamente complicadas y otras muy complejas, son llamadas técnicas de preparación. El resultado final de la utilización de cualquier técnica es un preparado microscópico que generalmente no defrauda al expectativa del observador. Aquí te indicaremos como puedes poner en práctica algunas técnicas sencillas.
En general, existen dos tipos de preparados: a) los “en fresco” o “in vivo”, que se abandonan después de que se examinan pues la materia viva comienza su desintegración y por consecuencia el preparado se altera; y b) los “duraderos” que se obtiene con técnicas más complicadas que consisten en la fijación de la materia viva, sumergiéndola en sustancias que la matan de inmediato pero que la mantienen con el mismo aspecto que si estuviera viva; y la coloración. Estos preparados una vez terminados reciben el nombre de laminillas histológicas. Estas se componen de tres capas: portaobjetos, tejido o muestra y cubreobjetos La técnica para realizar extendidos en fresco se explica en las págs. 20 para bacterias y fluidos, 20 para tejidos vegetales y 20 para tejidos animales. Los métodos “más profesionales” para la obtención de preparaciones histológicas ocupadas en los estudios de microscopía óptica, se engloban en la Técnica Histológica. La técnica histológica abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubreobjeto con imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio en microscopia óptica o electrónica. Los procedimientos son los siguientes: fijación, deshidratación, aclaramiento, inclusión, seccionado, montaje y tinción. Existen dos formas de obtener muestras tejidos para su observación:
– La necropsia → obteniéndolo del ser ya muerto
– La biopsia → Obteniéndola del ser vivo. Esta puede ser: inscisional, excisional, por sacabocado, por punción y absorción, por raspado, por trepanación


Fijación
Se le llama así al tratamiento del tejido con diversas sustancias químicas con la finalidad de conservar los tejidos como si estuvieran vivos interrumpiendo los procesos celulares que ocurren a la muerte de la célula deteniendo así la autólisis, aumentar su dureza para facilitar los cortes finos y ultra finos, y destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos. Los fijadores más usados son:
– Formaldehído al 5% (Micros. Opt.)
– Formol al 10% (Micros. Opt.) Es el más usado
– Formalina (solución de formaldehído especial) (Micros. Opt.)
– Glutaraldehído al 2.5% (Micros. Opt.) (Micros. Electr.)
– Tetróxido de Osmio (Micros. Opt.) (Micros. Electr.)
– Líquido de Helly (solución con 2.5g de bicromato de potasio, 5g de cloruro de mercurio, 100ml de agua y 5ml de formol) (Micros. Opt.)
– Fijador de Bouin ( 75ml de solución acuosa saturada de ácido pícrico, 25ml de formol, 5ml de ácido acético glacial)(Micros. Opt.)
– Cloruro de mercurio (Micros. Opt.)
– Ácido pícrico (Micros. Opt.)
– Glutaraldehído al 2.5%(Micros. Electr.)
– Paraformaldehído (Micros. Electr.)
– Permanganato de potasio (Micros. Electr.)
Siempre se debe tener en cuenta que la mejor fijación se obtiene cuando ha transcurrido el menor tiempo entre la muerte y la misma. Téngase en cuenta también que el tamaño de muestra debe ser, en lo posible, de entre dos y tres centímetros.


Deshidratación
La muestra luego de ser fijada debe ser deshidratada. Para ello se la sumerge consecutivamente en una serie gradual de soluciones acuosas deshidratantes como lo son el alcohol etílico o la acetona. Se inicia con alcohol a 50% durante uno o dos minutos, luego al 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, 98% hasta llegar al alcohol absoluto(100%). La deshidratación se realiza paulatinamente para evitar que el agua salga rápido del tejido y este se deforme


Aclaramiento o diafanización
La muestra es luego aclarada, es decir, se cambian sus índices de refracción. La sustancia aclarante debe ser miscible tanto en el fijador como en la sustancia de inclusión (comúnmente parafina). La sustancia más usada es el xilol. También se puede utilizar, tolueno, benzol o cloroformo. Si decide usar xilol, recuerde que tanto este como el alcohol disuelven los lípidos de las células.


Inclusión o impregnación
Los tejidos son incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme (gelatina o parafina) para facilitar los cortes posteriores. Para ello se coloca la muestra en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6hs, manteniendo la temperatura a 60º C. Por e calor el xilol se evapora y su lugar es ocupado por la parafina. Para microscopía electrónica se usan fucsinas polimerizadas tipo epoxi: Epon, Mikropal, Araldit. Luego se coloca todo en un molde hasta que solidifica a temperatura ambiente. Una vez seco se lo denomina taco


Corte
Según el grosor del corte que se desee (esto siempre va a depender de lo que se quiera observar y de la resolución del microscopio con que se va a usar) se utilizan diversos aparatos que nos cortan el taco en secciones lo suficientemente delgadas para dejar paso a la luz. La mayor parte de los preparados para microscopía óptica tienen un grosor de 3 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un micrótomo. Para microscopía electrónica se requieren cortes más delgados llamados ultra finos, de aproximadamente 25 a 100nm. de espesor y de 0.5mm de lado medio. Para esto se utiliza un micrótomo de hoja de vidrio o diamante (ultra micrótomo). Estos preparados se montan sobre rejillas de cobre común diámetro de 3mm.


Rehidratación
Para poder observar estos preparados al microscopio aún debemos desparinarlos y teñirlos. Para esto es necesario rehidratar nuevamente el preparado, para lo cual eliminamos la parafina con un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en xilo, y la muestra se rehidrata luego haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% de agua.


Otras técnicas de para la realización de preparados
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos de la técnica de congelación de tejidos. Un tejido congelado es lo suficientemente duro como para ser cortado. Para esto, se sumerge la muestra de tejido en nitrógeno líquido para tener una congelación rápida. Luego se corta con un aparato especial denominado micrótomo de congelación, existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de congelación llamado criostato. La ventaja de esta técnica es que los corte s que se obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnóstico de material patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de la operación.